RESUMO: A duplicação cromossômica de genótipos de azevém anual ( Lolium multiflorum Lam.) adaptados às condições edafoclimáticas brasileira é uma estratégia importante usada pelos melhoristas e visa a obtenção de genótipos mais vigorosos com melhor qualidade de forragem e resistência a doenças. A eficiência da duplicação cromossômica pode ser medida pela estabilidade genética e taxas de fertilidade das plantas ao longo das gerações. No entanto, um dos problemas comumente encontrados no processo de poliploidização é a regeneração de plantas mixoploides que apresentam comprometimento na fertilidade e instabilidade genética. O objetivo deste estudo foi verificar se progênies oriundas de plantas tetraploidizadas recentemente se mantêm estáveis quanto ao conteúdo de DNA e ao número cromossômico, ao longo de duas gerações. Foram avaliadas progênies de plantas de L. multiflorum tetraploidizadas artificialmente com tratamento de colchicina. A estabilidade genética foi avaliada por meio de contagens cromossômicas e estimativa da quantidade de DNA. A porcentagem de plantas tetraploides (4X) aumentou ao longo das gerações (18%, 34% e 91% no ciclo de 0, 1 e 2, respectivamente). Todas as progênies identificadas como tetraploides por meio de citometria de fluxo apresentaram variação no número cromossômico (mixoploidia), entretanto, produziram sementes viáveis. Os resultados demonstraram que a estabilização no número cromossômico e no conteúdo de DNA em progênies de plantas tetraploidizadas requer tempo e que o sucesso desse procedimento depende de um contínuo e rigoroso monitoramento e seleção.

ABSTRACT: Chromosome doubling of Italian ryegrass genotypes ( Lolium multiflorum Lam.) adapted to the brazilian edaphoclimatic conditions is an important strategy used by breeders and aims to obtain more vigorous genotypes with better forage quality and disease resistance. The effectiveness of chromosome doubling can be measured by genetic stability and fertility rates of plants over generations. However, a common problem in the polyploidization process is the regeneration of mixoploid plants that have impaired fertility and genetic stability. The objective of this study was to verify if progenies of recently tetraploidized plants remain stable regarding DNA content and chromosome number, over two generations. Progenies of L. multiflorum plants artificially tetraploidized with colchicine treatment were evaluated. Chromosome counting and estimates of the DNA content were used to evaluate the genetic stability. The percentage of tetraploid plants (4X) increased over generations (18%, 34% and 91% in cycle 0, 1 and 2, respectively). All progenies identified as tetraploid by flow citometry showed variation in chromosome number (mixoploidy), but produced viable seeds. Results showed that stabilization in chromosome number and DNA content in tetraploidized plant progenies requires time and that the success of this procedure depends on a continuous and accurate screening and selection.

A duplicação cromossômica artificial de genótipos diploides de Lolium multiflorum (2n=2x=14) é importante para melhoristas, pois visa aumentar a expressão de caracteres de interesse agronômico. O objetivo deste trabalho foi obter plantas poliploides de L. multiflorum de populações locais diploides para explorar a adaptação e verificação futura dos efeitos da poliploidia sobre as características agronômicas. Plântulas foram imersas em diferentes soluções de colchicina, com tempo de exposição de 3 e 24 horas. A determinação da ploidia foi feita pelo conteúdo de DNA e certificada pela contagem cromossômica. As plantas efetivamente confirmadas como tetraploides foram mantidas em casa de vegetação e, no florescimento, foi feita a avaliação da viabilidade polínica e colheita sementes para avaliar a estabilidade das progênies. A porcentagem de poliploides obtidos foi de 20%. A viabilidade polínica das plantas tetraploidizadas variou de 58% a 69%. As plantas tetraploides obtidas geraram 164 progênies, das quais 109 apresentaram conteúdo de DNA compatível com o nível tetraploide, demonstrando estabilidade da duplicação cromossômica na geração filial.

Artificial chromosome duplication of diploid genotypes of Lolium multiflorum (2n=2x=14) is worthy to breeding, and aims to increase the expression of traits with agronomic interest. The purpose of this study was to obtain polyploid plants of L. multiflorum from local diploid populations in order to exploit adaptation and future verification of the effects of polyploidy in agronomic traits. Seedlings were immersed in different colchicine solutions for an exposure time of 3h and 24h. Ploidy determination was made by the DNA content and certified by chromosomes counts. The plants confirmed as tetraploids were placed in a greenhouse, and, at flowering, pollen viability was evaluated, and seeds were harvested to assess the stability of the progenies. The percentage of polyploids obtained was 20%. Pollen viability of the tetraploids generated ranged from 58% to 69%. The tetraploid plants obtained in the experiment generated 164 progenies, of which 109 presented DNA content compatible with the tetraploid level, showing stability of chromosome duplication in the filial generation.

Os programas de melhoramento de Brachiaria spp. utilizam os cruzamentos intraespecíficos e interespecíficos entre plantas sexuais e apomíticas para obtenção de novas cultivares com características desejadas. Como existem diferentes níveis de ploidia dentro e entre as espécies deste gênero, torna-se necessária a avaliação dos genótipos utilizados em programas de melhoramento para a orientação das estratégias de cruzamentos adotadas pelos melhoristas. Neste trabalho, o conteúdo de DNA e o número cromossômico foram determinados para caracterizar o nível de ploidia de genótipos de Brachiaria spp. Na análise de 15 genótipos, o conteúdo de DNA variou de acordo com o nível de ploidia (2x, 3x e 4x) e entre espécie e/ou taxon. O conteúdo de médio de DNA foi de 1,74 pg (2x) para B. ruziziensis, 3,74 pg (4x) para B. decumbens e de 3,52 pg (4x) para B. brizantha. Para o genótipo 86 obteve-se 2,57 pg de DNA e 2n = 3x = 27, indicando tratar-se de um acesso triplóide, provavelmente um híbrido natural. A variação no conteúdo de DNA total permitiu diferenciar Brachiaria ruziziensis (2n = 2x = 18) das espécies tetraploides (2n = 4x = 36) Brachiaria decumbens e Brachiaria brizantha, bem como o provável híbrido triplóide (2n = 3x = 18) dessas espécies.

Breeding programs for Brachiaria spp. use both intraspecies and interspecies crosses between sexual and apomictic plants in order to obtain new cultivars with the desired characteristics. As there are different ploidy levels both within and between species of this genus, it becomes necessary to evaluate the genotypes used in breeding programs, as a guide to breeders when adopting crossing strategies. In this work, DNA content and chromosome number were determined in order to characterise ploidy levels in Brachiaria spp. genotypes. In the analysis of 15 genotypes, DNA content varied with the ploidy levels (2x, 3x and 4x), and between species and/or taxon. The average DNA content was 1.74 pg (2x) in B. ruziziensis, 3.74 pg (4x) in B. decumbens and 3.52 pg (4x) for B. brizantha. For the genotype 86, 2.57 pg of DNA was obtained and 2n = 3x = 27, indicating a triploid accession, probably a natural hybrid. The variation in the total DNA content allowed the differentiation of Brachiaria ruziziensis (2n = 2x = 18) from the tetraploid species Brachiaria Brizantha and Brachiaria decumbens (2n = 4x = 36), as well as the probable hybrid triploid (2n = 3x = 18) of these species.

The objective of the present work was to induce chromosome doubling in genotypes of Brachiaria ruziziensis with potential for production of good-quality biomass and tolerance/resistance to stress caused by aluminum and spittlebugs. Germinated seeds of B. ruziziensis were immersed in 0.1% colchicine solution for 2 or 3 hours. Ploidy level was determined by flow cytometry and confirmed by chromosome count. Fertility of the tetraploid plants was assessed through evaluation of pollen viability by staining. There was no statistical difference with regard to seedling survival and number of duplicate seedlings between the treatments. Survival rate was 8%, of which 11.45% were tetraploid genotypes. The mean viability of pollen grains from the evaluated tetraploid plants ranged from 51.75 to 55.50%. So, the tetraploids plants obtained from genotypes of a bred population of ruzigrass produce fertile pollen, in percentages that render crosses viable in genetic breeding programs.

A citometria de fluxo permite estimar o conteúdo de DNA de um grande número de plantas rapidamente. No entanto, protocolos inadequados podem comprometer a confiabilidade dessas estimativas, levando a variações nos valores de conteúdo de DNA para uma mesma espécie. Neste trabalho, objetivou-se propor um protocolo eficiente para a estimativa do conteúdo de DNA de genótipos de Brachiaria spp. com diferentes níveis de ploidia, utilizando a citometria de fluxo. Foram avaliados quatro genótipos (B. ruziziensis, diploide e tetraploidizada artificialmente; B. brizantha tetraploide e um híbrido natural triploide), 3 soluções tampões (MgSO4, Galbraith e Tris-HCl) e três espécies como padrões de referência interno (Raphanus sativus, Solanum lycopersicum e Pisum sativum). As variáveis mensuradas foram: nota do histograma (1 a 5), coeficiente de variação e estimativa do conteúdo de DNA. A melhor combinação para as análises do conteúdo de DNA de Brachiaria spp. por citometria de fluxo foi o emprego do tampão MgSO4 com o rabanete como padrão de referência. O tamanho dos genomas expresso em picogramas de DNA foi apresentado para todos os genótipos e a importância da pontuação do histograma na confiabilidade dos resultados das análises do conteúdo de DNA foi discutida.

Flow cytometry allows to estimate the DNA content of a large number of plants quickly. However, inadequate protocols can compromise the reliability of these estimates leading to variations in the values of DNA content the same species. The objective of this study was to propose an efficient protocol to estimate the DNA content of Brachiaria spp. genotypes with different ploidy levels using flow cytometry. We evaluated four genotypes (B. ruziziensis diploid and artificially tetraploidized; a tetraploid B. brizantha and a natural triploid hybrid), three buffer solutions (MgSO4, Galbraith and Tris-HCl) and three species as internal reference standards (Raphanus sativus, Solanum lycopersicum e Pisum sativum). The variables measured were: histogram score (1-5), coefficient of variation and estimation of DNA content. The best combination for the analysis of Brachiaria spp. DNA content was the use of MgSO4 buffer with R. sativus as a internal reference standard. Genome sizes expressed in picograms of DNA are presented for all genotypes and the importance of the histogram score on the results reliability of DNA content analyses were discussed.

A obtenção artificial de genótipos com duplicação cromossômica em forrageiras busca maximizar características de interesse agronômico, como valor nutricional e produção de forragem, resistência a pragas e doenças, tolerância a estresses abióticos e restauração da fertilidade de híbridos estéreis. Outro objetivo da duplicação cromossômica é a geração de variabilidade genética em espécies apomíticas, por meio da duplicação cromossômica de acessos sexuais igualando a ploidia de modo a permitir a realização de cruzamentos e a obtenção de descendentes férteis. A indução de poliploidia é feita utilizando substâncias antimitóticas, sendo a colchicina a mais amplamente usada em plantas forrageiras. Entretanto, devido a sua toxicidade, outras substâncias como herbicidas e cafeína vem sendo empregadas com sucesso em gramíneas. A eficácia na obtenção de poliploides artificialmente depende de uma série de fatores exógenos, tais como as substâncias antimitóticas utilizadas, o tipo de explante, o tempo e as condições de exposição e as concentrações dos antimitóticos. Esta revisão tem por objetivo apresentar os principais métodos usados para indução de poliploidia em gramíneas forrageiras e os avanços obtidos no melhoramento genético, a partir do uso de genótipos poliploidizados.

The artificial obtaining of duplicate genotypes aims to maximize forage characteristics of agronomic interest, such as nutritional value and forage production, resistance against pests and diseases, abiotic stress tolerance and fertility restoration in sterile hybrids. It also aims to obtain genetic variability in apomictic species through chromosome doubling of the sexual accesses by equaling the ploidy in order to allow crossings and the obtaining of fertile descendents. The polyploidy induction is made using antimitotic substances, and colchicine is the most widely used in forage. However, due to its toxicity, other substances such as herbicides and caffeine has been used successfully for grasses. The efficiency in obtaining the polyploidy artificially depends on various exogenous factors, such as the antimitotic substances used, the kind of explants, the time and the exposure conditions and the antimitotic concentrations. This review aims to present the main methods used to induce polyploidy in grasses and the progress obtained in genetic breeding by the use of artificially duplicate genotypes.